本來，
定量PCR儀是為了將樣本中微量的DNA模版放大以便研究模版特性，隨著研究的深入，要了解樣本中基因的表達模式與疾病的關(guān)系，就需要了解標本中的DNA原始拷貝數(shù)。理論上定量PCR儀試驗過程中反應(yīng)產(chǎn)物是以指數(shù)規(guī)模增長的，但實際的PCR擴增曲線并不是標準的指數(shù)曲線，而是S形曲線——因為隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，擴增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率降低，產(chǎn)物生成的速度逐漸減緩，終進入平臺期。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的PCR反應(yīng)體系進入平臺期的時間和平臺期的高低都有很大變化，即使是重復(fù)實驗，各種條件基本一致，后得到的DNA拷貝數(shù)也往往不同。因此經(jīng)過
定量PCR儀擴增的DNA產(chǎn)物量不能反映起始模板量的真實情況。通過傳統(tǒng)凝膠電泳EB染色或者同位素標記只能定量PCR的終產(chǎn)物量，而不能定量起始DNA模版的拷貝數(shù)。
常用的定量PCR儀熒光標記方法可簡單分為兩大類：
1.非特異檢測——雙鏈DNA內(nèi)插式熒光染料；
2.擴增序列專一檢測——主要指熒光探針和引物探針。熒光染料技術(shù)成本低廉，實驗設(shè)計簡便；
而探針雜交技術(shù)在原理上嚴格，所得數(shù)據(jù)特異性高、更為。在選擇實驗方案時要根據(jù)定量PCR儀實驗?zāi)康暮蛯?shù)據(jù)精度的要求來決定。
非特異性檢測擴增序列的代表是熒光染料。只與DNA雙鏈結(jié)合，插入DNA雙鏈時發(fā)出熒光；DNA雙鏈解鏈時釋放出來，熒光信號急劇減弱。在一個加入過量熒光染料的體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。熒光染料法定量PCR的基本過程是：開始反應(yīng)，當(dāng)染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。DNA變性時，染料釋放出來，熒光急劇減少。在聚合延伸完成后，染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量定量PCR儀系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。I的大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長大約為520nm。
定量PCR儀熒光染料的優(yōu)勢在于能監(jiān)測各種雙鏈DNA序列的擴增，無需設(shè)計探針，檢測簡單簡便，成本低廉。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，對DNA模板沒有選擇性，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結(jié)合，使實驗容易產(chǎn)生假陽性信號，引物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線分析的軟件加以解決。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對定量PCR儀引物設(shè)計的特異性和PCR反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。
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